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Module1

* Chinese [,tʃai'ni:z] n. 中文，漢語；中國人。adj. 中國的，中國人的；中國話的

* from [強frɔm, 弱frəm] prep. 來自，從…..來

* where [hwεə] adv. 在哪裏

* year [ jiə] n. 年；年齡

* about [ə'baut] prep. 關於；大約

what about ……？ ….怎麽樣？

* Ms [miz] n.女士

* America [ə'merikə] n. 美國；美洲（包括北美和南美洲）

* not [nɒt] adv. 不（用於否定句），不是，沒有

* England ['iŋɡlənd] n. 英格蘭；英國

* hi [hai] int. 嗨！餵

* American [ə'merikən] n. 美國人，美洲人；

adj. 美國的，美國人的，美洲的

* our ['auə] pron. 我們的

* grade [ɡreid] n. 年級；等級

* he [hi:,hi] pron. 他

* China ['tʃaɪnə] n. 中國

* everyone ['evriwʌn] pron. 每個人；大傢

* capital ['kæpitəl] n. 首都，省會

* but [bʌt] conj. 但是；然而

* very ['veri] adv. 非常，很

* big [biɡ] adj. 大的；重要的

* city ['siti] n. 城市，都市

* small [smɔ:l] adj. 少的，小的

* first [fə:st] adj. 第壹的；首要的；adv. 先；首先；

first name 名字

* last [lɑ:st] adj. 最後的；最末的。adv. 最後；最末

last name 姓

* all [ɔ:l] pron. 全體，每個

Module2

* aunt [ɑ:nt] n. 阿姨；姑媽；伯母；舅媽

* brother ['brʌðə] n. 兄弟

* cousin ['kʌzən] n. 堂兄弟姊妹；表兄弟姊妹

* daughter ['dɔ:tə] n. 女兒

* family ['fæmili] n. 家庭；傢族

* father ['fɑ:ðə] n. 父親，爸爸

* grandfather ['ɡrænd,fɑ:ðə] n. （外）祖父

* grandmother ['ɡrænd,mʌðə] n. （外）祖母

grandparent ['ɡrænd,pεərənt] n. （外）祖父母

* mother ['mʌðə] n. 母親，媽媽

* parent ['pεərənt] n. 父親（或母親）；父母親

* sister ['sistə] n. 姐妹；修女；護士

son [sʌn] n. 兒子；孩子

* uncle ['ʌŋkl] n. 叔叔；伯父；伯伯；舅父；姨丈；姑父

* photo['fəutəu] n. 照片，相片

* photograph ['fəutəɡrɑ:f] n. 照片，相片

* these [ði:z] pron. 這些

* they [ðei] pron. 他們；牠們；她們

* mum [mʌm] n. 媽媽（口語）；

* left [left] n. 左邊；左側。adj. 左邊的；左側的

* on the left 在左邊，在左側

* dad [dæd] n. 爸爸；爹爹

* right [rait] n. 正確；右邊；右側。adj. 正確的；右邊的；右方的

* on the right 在右邊，在右側

* who [hu:] pron. 誰

* woman ['wumən] n. 婦女；女性；成年女子

women ['wimin] n. 女人（woman的復數）

* next [nekst] adj. 緊挨著，緊靠著；adv.緊接下來地，下壹步

next to 在……旁邊，緊挨著。

husband ['hʌzbənd] n. 丈夫

front [frʌnt] n. 前麵；正麵

in front of 在···的前麵

* those [ðəuz] pron. 那些（that的復數）

* bus [bʌs] n. 公共汽車

station ['steiʃən] n. 站；車站

hospital ['hɔspitəl] n. 醫院

hotel [həu'tel] n. 旅館，飯店

* police [pə'li:s] n. 警察，警方

theatre（Am E theater） ['θiətə] n. 電影院，劇院；

actor ['æktə] n. 男演員

* driver [draivə] n. 駕駛員；司機

manager ['mænidʒə] n. 經理

* nurse [nə:s] n. 護士

policeman [pə'li:smən] n. 男警察

policemen [pə'li:smən] n. 男警察（policeman的復數形式）

* we [wi:] pron. 我們（主格）；

* an [æn, ən ] art. 壹（個，件···）（在元音字母前）

job [dʒɔb] n. 工作；職業

* at [æt, ət] prep. 在···，在···里。

same [seim] adj. 相同的；同壹的；

* doctor [dɔktə] n. 醫生；博士

* farm [fɑ:m] n. 農場；農傢

* worker ['wə:kə] n. 工人；勞動者

* man [mæn] n. 人；男人

men ['men] n. 男人，人類（man的復數）

* shop [ʃɔp] n. 商店；店鋪

* its [its] pron. 牠的http:// www .xkb1.com

* their [ðεə] pron. 他們的，她們的；牠們的

Module3

* Computer [kəm'pjuːtə] n. 計算機；電腦

furniture ['fə:nitʃə] n. 傢具（總稱）；

* map [mæp] n. 地圖

* picture ['piktʃə] n. 照片，圖片

television ['teli,viʒən] =TV n. 電視，電視機

wall [wɔ:l] n. 墻壁，圍墻

thirty ['θə:ti] num. 三十

forty ['fɔ:ti] num. 四十

forty復數forties

fifty ['fifti] num. 五十

sixty ['siksti] num. 六十

seventy ['sevənti] num. 七十

eighty ['eiti] num. 八十

ninety ['nainti] num. 九十

really ['riəli] adv. 非常，很；真正地

* many ['meni] adj. 許多的，很多

how many 多少

there [ðeə] pron. （用於引導句子的主語）

lot [lɔt] n. 大量，許多

a lot of 大量；許多

oh [əu] int. 哦；哎呀（表示驚訝或恐懼等）

* any ['eni] adj. 任何的，壹些；pron. 任何；任何壹個

world [wə:ld] n. 世界

* tree [tri:] n. 樹；樹木

building ['bildiŋ] n. 建築；建築物

hall [hɔ:l] n. 大廳；會堂

dining hall 飯廳，飯堂

gate [ɡeit] n. 大門；出入口

* library ['laibrəri] n. 圖書館，藏書室

office ['ɔfis] n. 辦公室；政府機關

* playground ['pleiɡraund] n. 運動場，操場

* science ['saiəns] n. 科學；科學課

lab [læb] n. [口]實驗室，研究室

laboratory [lə'bɔrətəri] n. 實驗室

* behind [bi'haind] prep. 在···後麵；

* between [bi'twi:n] prep. 在…之間

middle ['midl] n. 中間，中央

* near [niə] prep. 靠近；接近

* with [wið] prep. 和；具有（品質，特徵）；和…在壹起

* for [fɔ:, fə] prep. 為，為了

* room [ru:m] n. 房間；室，屋子

Module4

* food [fu:d] n. 食物；食品

* drink [driŋk] n. 飲料；vt. 喝

* candy ['kændi] n. 糖果（等於sweets）；

* fruit [fru:t] n. 水果；產物

meat [mi:t] n. 肉，肉類（食用）

* vegetable ['vedʒitəbl] n. 蔬菜

* apple ['æpl] n. 蘋果

bean [bi:n] n. 豆

beef [bi:f] n. 牛肉

carrot ['kærət] n. 胡蘿蔔

* chicken ['tʃikin] n. 雞肉；小雞

chocolate ['tʃɔkəlit] n. 巧克力

coffee ['kɔfi] n. 咖啡；咖啡豆；

cola ['kəulə] n. 可樂

* juice [dʒu:s] n. （水果）汁，果汁

* milk [milk] n. 牛奶

* potato [pə'teitəu] n. 土豆，馬鈴薯

* tea [ti:] n. 茶葉；茶樹

* tomato [tə'mɑ:təu] n. 番茄，西紅柿

* water ['wɔ:tə] n. 水

* shop [ʃɔp] vi. 購物；買東西

go shoping 去買東西，去購物

* have [hæv, həv] aux. 助動詞。vt. 有，吃，喝

* get [ɡet] vt. 得到；獲得

have got 有；擁有

* some [sʌm] adj. 壹些；若幹；少量。pron. 壹些；某些

* much [mʌtʃ] adj. 大量的，許多。

too much 太多

* kind [kaind] n. 種類；

lots of 許多，大量

so ['səu] conj. 所以；因此

How about···？ （徵求意見）···好嗎？···行嗎？

* has [hæz, 弱 həz] vt. 有；吃（have的第三人稱單數現在式）；

* bad [bæd] adj. 壞的；不好的

* healthy ['helθi] adj. 健康的

delicious [di'liʃəs] adj. 美味的

* bread [bred] n. 麵包；

* fish [fiʃ] n. 魚，魚類

hamburger ['hæmbə:ɡə] n. 漢堡包，漢堡

* ice cream [,ais'kri:m] 冰淇淋

* noodle ['nu:dl] n. 麵條；[俚]笨蛋

* rice [rais] n. 稻；米飯

sugar ['ʃuɡə] n. 糖；食糖

* eat [i:t] v. 吃

* child [tʃaild] n. （14歲以下的）兒童，孩子

children ['tʃildrən] n. 孩子們（child的復數）

be good for 對···有幫助的

sweet [[swi:t]] adj. 甜的

be bad for 對···有害的

* right [rait] adj. 正確的，對的

* egg [eɡ] n. 蛋；雞蛋

* eye [ai] n. 眼睛；視力

cheese [tʃi:z] n. 奶酪；幹酪

tooth [tu:θ] n. 牙齒

teeth [ti:θ] n. 牙齒的復數

bit [bit] n. 壹點，少許

a bit 稍微，有點兒

* face [feis] n. 臉；表面

* tired ['taiəd] adj. 勞累的

* soup [su:p] n. 湯，羹

important [im'pɔ:tənt] adj. 重要的，重大的

remember [ri'membə] vi. 記住，記起

* well [wel] adv. 很好地

stay [stei] v. 停留；保持

fat [fæt] adj. 肥的，胖的

get fat 發胖

* or [ɔ:] conj. 或，或者

* breakfast ['brekfəst] n. 早餐，早飯

* every ['evri] adj. 每壹的，每個的

* lunch [lʌntʃ] n. 午餐

* home [həum] n.傢；家庭

* dinner ['dinə] n. 晚餐，正餐

* banana [bə'nɑ:nə] n. 香蕉

* buy [bai] v. 買

Module5

* half [hɑ:f] n. 壹半

* past [pɑ:st] prep. 過（幾點）；晚於

o`clock [ə`klɔk] adv.···點鐘

* to [tu:, tu, 輔音前弱tə] prep. 到；（距整點時間）差···

* art [ɑ:t] n. 藝術；美術

geography [dʒi'ɔɡrəfi] n. 地理；地形

history ['histəri] n. 歷史，歷史學

IT [.aɪtiː] n. 信息技術

* maths [mæθs] n. 數學（等於mathematics）

* PE[.pi`I:] n. 體育；體育課

* PE=physical education ['fizikəl ,edju:'keiʃən] n. 體育；體育課

* lesson ['lesən] n. （壹節）課

* then [ðen] adv. 然後；接著

* like [laik] vt. 喜歡；喜愛

* difficult ['difikəlt] adj. 困難的；難懂的

* love [lʌv] n. 喜愛；關愛。vt. 喜歡；熱愛

* subject ['sʌbdʒikt] n. 主題；科目

because [bi'kɔz] conj. 因為

* interesting [intrəstiŋ] adj. 有趣的

* talk [tɔ:k] vt. 說話；談論

* begin [bi`gin] vt. 開始

* when [hwen] adv. 什麽時候，何時

go to school 上學

weekday ['wi:kdei] n. 平日，工作日

get up 起床

have breakfast 吃早餐

* house [haus] n.房子、住宅

start [stɑ:t] vt. 開始；啟動

* work [wə:k] n. 工作，學習； v. 工作，學習

break [breik] n. （課間）休息，

have lunch 吃午餐

go home 回傢

* evening ['i:vniŋ] n. 晚上；傍晚

* watch [wɔtʃ] vi. 觀看，看。

have dinner 吃飯，吃晚餐

* do [du:] vt. 做；幹

homework ['həumwə:k] n. 家庭作業，課外作業

* bed [bed] n. 床；

go to bed 去睡覺

* sleep [sli:p] vi. 睡覺。n. 睡覺

go to sleep 開始睡覺，入睡

* park [pɑ:k] n. 公園；停車場

* busy ['bizi] adj. 忙碌的；繁忙的

* wash [wɒʃ] vt. 洗滌；洗

* minute ['minit] n. 分，分鐘

Revision module A

* grandma ['ɡrændmɑ:] n. 奶奶；外祖母

* grandpa ['ɡrændpɑ:] n. [口]爺爺；[口]外公

* him [him] pron. 他（賓格）

* want [wɒnt] vt. 需要；想要

* make [meik] vi. 做，製作

* kitchen ['kitʃin] n. 廚房

* farmer ['fɑ:mə] n. 農夫，農民

* week [wi:k] n. 周，星期

* read [ri:d] vt. 閱讀；看懂

* story ['stɔ:ri] n. 故事；小說

* live [lɪv] vi. 生活；居住

Module6

bear [beə] n. 熊

elephant ['elifənt] n. 象

giraffe [dʒi'rɑ:f] n. 長頸鹿

lion ['laiən] n. 獅子

monkey ['mʌŋki] n. 猴子

panda ['pændə] n. 熊貓

tiger ['taiɡə] n. 老虎

zebra ['zi:brə] n. 斑馬

zoo [zu:] n. 動物園

guide [ɡaid] n. 導遊

animal ['æniməl] n. 動物

such [sʌtʃ] adj. 這樣的，如此的

as [æz] prep. 如同，像…壹樣

such as 比如

come [kʌm] vi. 來

come from 來自

different ['difərənt] adj. 不同的

country ['kʌntri] n. 國傢；故鄉

other ['ʌðə] adj. 其他的

dangerous ['deindʒərəs] adj. 危險的

ugh [ʌɡ] int. 啊，哎呀

also ['ɔ:lsəu] adv. 也；而且

plant [plɑ:nt, plænt] n. 植物

look [luk] vt. 看，瞧

look at 看

tall [tɔ:l] adj. 高的

leaf [li:f] n. 葉子

sure [ʃuə] adv. 當然；的確

bamboo [bæm'bu:] n. 竹

cute [kju:t] adj. 可愛的

shall [ʃæl, ʃəl] aux. ···好嗎？要不要···？

them [ðem, ðəm] pron. 他們；牠們；她們

which [hwitʃ] pron. 哪/那壹個

over ['əuvə] prep. 越過；在…上方

there [ðεə] adv. 在那裏；往哪裏

over there 在那邊，在那裏

funny ['fʌni] adj. 有趣的

call [kɔ:l] vi. 把···叫做；稱呼···為

Africa ['æfrikə] n. 非洲

Asia ['eiʃə] n. 亞洲

Europe ['juərəp] n. 歐洲

little ['litl] adj. 極少的

a little 少量

only ['əunli] adv. 隻，僅僅

about [ə'baut] adv. 大約 大致

kilo ['ki:ləu] n. 千克；公斤

kilo= kilogram ['kiləuɡræm] n. 公斤；千克

people ['pi:pl] n. 人；人們

all over the world 全世界

African ['æfrikən] adj. 非洲的，非洲人的。N.非洲人

as well as 並且，還

grass [ɡrɑ:s] n. 草

large [lɑ:dʒ] adj. 大的；巨大的

usually ['ju:ʒuəli] adv. 通常，經常

alone [ə'ləun] adv. 獨自地

be good at 擅長

strong [strɒŋ] adj. 強大的；強壯的；強烈的

catch [kætʃ] v. 抓住；抓住

many kinds of 許多種類

even ['i:vən] adv. 甚至

Module7

keyboard ['ki:bɔ:d] n. 鍵盤

mouse [maus] n. 鼠標；老鼠

mice [mais] n. 老鼠（mouse的復數）

screen [skri:n] n. 屏幕

connect [kə'nekt] vt. 連接

turn [tз:n] vt. 轉動

turn on 打開

learn [lə:n] vt. 學習；學

document ['dɔkjumənt] n. 文件

click [klik] vt. 點擊

use [ju:z] vi. 使用

save [seiv] vt. 儲存；保存；

box [bɔks] n. （計算機屏幕上的）框，盒子

finally ['fainəli] adv. 最後

print [print] vt. 印刷；打印

paper ['peipə] n. 紙；論文

share [ʃεə] vi. 共享；分享

Australia [ɔ'streiljə] n. 澳大利亞，澳洲

company ['kʌmp(ə)ni] n. 公司；劇團

often ['ɒf(ə)n] adv. 經常

customer ['kʌstəmə] n. 顧客

internet ['intənet] n. 因特網

check [tʃek] vt. 檢查；查看

train [trein] n. 火車

travel ['trævəl] n. 旅行

plan [plæn] n. 計劃。vi. 計劃；打算

ticket ['tikit] n. 票

music ['mju:zik] n. 音樂，樂曲

movie ['mu:vi] n. 電影

night [nait] n. 夜晚

search [sə:tʃ] vt. 搜索；搜尋；查找

search for 搜尋；查找

information [,infə'meiʃən] n. 信息

email ['i:meil] n. 電子郵件

send [send] vt. 發送

game [ɡeim] n. 遊戲

sometime ['sʌmtaim] adv. 有時候；不時

cinema ['sinəmə] n. 電影；電影院

clothes [kləuðz] n. 衣服（總稱）

visit ['vizit] vt. 探望；參觀

holiday ['hɔlədi] n. 假日；節日

Module8

card [kɑ:d] n. 卡片

party ['pɑ:ti] n. 晚會；聚會

present ['prezənt] n. 禮物

would [wud] aux. 肯，會；願意。v. will的過去式

always ['ɔ:lweiz] adv. 壹直；總是

great [ɡreit] adj. 巨大的；太好了；超乎尋常的

cake [keik] n. 蛋糕

never ['nevə] adv. 從不

special ['speʃəl] adj. 特別的；特殊的

cut [kʌt] vt. 切；剪

give [ɡiv] vt. 給；送

sing [siŋ] vt. 唱；唱歌

happy ['hæpi] adj. 幸福的；高興的

secret ['si:krit] n. 秘密

ha ha [hɑː'hɑː] 哈哈 （表笑聲）

CD [,si: 'di:] abbr. 光盤，激光唱片

concert [kən'sət] n. 音樂會

magazine [,mæɡə'zi:n] n. 雜誌

scarf [skɑ:f] n. 圍巾

silk [silk] n. 絲綢

dress [dres] n. 連衣裙；禮服

T-shirt ['ti,ʃɝt] n. T恤衫

choose [tʃu:z] vi. 選擇，挑選

exercise ['eksəsaiz] n. 鍛煉；練習

wear [wεə] v. 穿；戴

expensive [ik'spensiv] adj. 昂貴的

shoe [ʃu:] n. 鞋，鞋子

spend [spend] vi. 花錢；花費

money ['mʌni] n. 錢；金錢

film [film] n. 電影

song [sɔŋ] n. 歌曲

match [mætʃ] n. 比賽，競賽

weekend [,wi:k'end] n. 周末

at weekends 在周末

dear [diə] adj. 親愛的（用於信開頭某人的名字前）

hear [hiə] vi. 聽見

hear from 收到···的來信

afraid [ə'freid] adj. 害怕的；擔心的

I'm afraid [口] 恐怕（用於禮貌地拒絕）

can`t =cannot 不能

Module9

postcard ['pəustka:d] n. 明信片

call [kɔ:l] vi. 呼叫；給··打電話

lie [lai] vi. 躺，平躺

sun [sʌn] n. 太陽

line [lain] n. 行，排，列

take [teik] vt. 拿，取，花費（時間）

take photos 拍照

wait [weit] vt. 等候；等待

wait for 等待；等候

walk [wɔ:k] vi. 行走，步行

trip [trip] n. 旅行

few [fju:] adj. 很少的；壹些；幾個

a few 壹些；幾個

sale [seil] n. 賣；出售

on sale 正在出售

enjoy [in'dʒɔi] vt. 喜愛，享受··的樂趣

anyway ['eniwei] adv. 無論如何；儘管如此

back [bæk] adv. 回到；向後；返回

go back 回去

drive [draiv] v. 駕駛；駕車

off [ɒf] prep. 離開；下（飛機、火車、汽車等）

get off 下（飛機、火車、公共汽車等）

hot dog 熱狗（壹種中間加香腸的三明治）

leave [li:v] vi. 離開

restaurant ['restərɔŋ] n. 餐館；飯店

moment ['məumənt] n. （某事發生的）時刻、時候

place [pleis] n. 地點

thing [θiŋ] n. 事情；東西

most [məust] adj. 大部分的，多數的

still [stil] adv. 仍然；依舊

star [stɑ:] n. 星；明星；星狀物

run [rʌn] vi. 跑；奔跑

study ['stʌdi] vt. 學習；研究

Module10

lantern ['læntən] n. 燈籠；

dragon ['dræɡən] n. 龍

dance [dɑ:ns] n. 舞蹈；vi. 跳舞

clean [kli:n] vi. 打掃；adj. 清潔的，幹凈的

sweep [swi:p] vi. 清掃，打掃；

floor [flɔ:] n. 地闆

cook [kuk] vt. 烹調，煮，燒

speak [spi:k] vi. 說話；講話

happen ['hæpən] vi. 發生

ready ['redi] adj. 有準備好；準備好的

get ready for 為···做好準備

festival ['festəvəl] n. 節日

quite [kwait] adv. 十分；相當

at the moment 此刻，目前

beautiful ['bju:tiful] adj. 美麗的；漂亮的

at work 在工作

away [ə'wei] adv. 在安全的地方；在通常存放的地方、

put away 收起；收拾好

hard [hɑ:d] adv. 努力地 adj. 艱難的；困難的

join [dʒɔin] vt. 參加；加入

hurry ['hʌri, 'hə:ri] vi. 匆忙，趕快

hurry up 趕快

Christmas ['krisməs] n. 聖誕節

January ['dʒænjuəri] n. 壹月

February ['februəri] n. 二月

before [bi'fɔ:] prep. 在…之前

sweep away 掃去

luck [lʌk] n. 運氣

table ['teibl] n. 桌子

celebrate ['selibreit] vt. 慶祝

traditional [trə'diʃənəl] adj. 傳統的

dumpling ['dʌmpliŋ] n. 餃子，湯團

programme（Am E program） ['prəuɡræm] n. （電視）節目

sweater ['swetə] n. 毛線衣，厚運動衫

coat [kəut] n. 外套

mean [mi:n] vt. 意味著；意思是

lucky ['lʌki] adj. 幸運的

merry ['meri] adj. 愉快的；高興地

Merry Christmas 聖誕快樂

tell [tel] vt. 告訴；講

Revision module B

think [θiŋk] v. 想；認為

«——【 ·前言· 】——»

在真核細胞中，基因表達的調控是壹個高度精細的過程，其中前體mRNA（pre-mRNA）的剪接是壹個關鍵步驟，決定了最終編碼蛋白質的組成。前體mRNA剪接的準確性和調控對於維持細胞正常功能至關重要。因此，了解參與調控前體mRNA剪接的分子機制對於揭示細胞生物學過程的底層原理以及與疾病相關的異常情況具有重要意義。

本文的目的在於深入研究SANS通過介導三snRNP復合物的核內轉移來調節前體mRNA剪接的機制。我們將結合細胞生物學、分子生物學和生物化學方法，通過構建細胞模型，模擬SANS缺失和突變的情況。通過定位SANS與snRNP復合物的相互作用，我們希望揭示SANS在前體mRNA剪接調控中的具體功能。這項研究不僅有助於深入理解前體mRNA剪接的調控機制，還為解析Usher綜合症的分子基礎提供了新的線索，為未來的治療策略和幹預手段提供了潛在的目標。總之，本研究將為我們對細胞基因表達調控的認識邁出重要的壹步。

«——【 ·脫氧核糖核酸構建體· 】——»

如前所述，在內部設計和克隆了3xFLAG標記的SANS全長和刪除結構。通過PCR從HA-PRPF31質粒中產生PRPF1（N項（aa165-166），C項（aa499-31））的缺失構建體，並將其克隆到pcDNA3.1N-HA載體中。

PRPF6（NTD（aa1–126）、HAT1-6（aa293–592）、HAT7-13（aa593–941））的缺失構建體被克隆到AcGFP-C1載體中。USH1C微型基因是從HEK293T細胞的基因組DNA中擴增並克隆到pcDNA5/FRT載體（ThermoFisher）中的。

pcDNA5/FRT-PRPF4質粒是通過將與N末端FLAG/HA標簽融合的PRPF4基因克隆到pcDNA5/FRT質粒中構建的。

«——【 ·酵母二雜交（Y2H· 】——»

如前所述，使用HybriZAP雙雜交cDNA合成試劑盒（美國拉霍亞Stratagene）進行酵母雙雜交（Y2H）篩選（35）。DNA結合結構域（pBD）與人類SANS（氨基酸126-368）的CENT結構域融合（NCBI：NM_173477），並用作牛寡核苷酸-dT引發的視網膜cDNA文庫中的誘餌。

通過評估β-半乳糖苷酶報告基因的激活來分析相互作用。通過在X-ß-gal比色濾光片提昇測定（LacZ報告基因）中對酵母克隆進行染色來檢測蛋白質對之間的相互作用。

對於倒易1：1Y2H測定，將融合到GAL3轉錄因子的DNA活化結構域（pAD）的牛SF1B389（aa500–4）獵物和融合到GAL4轉錄因子的DNA結合結構域（pBD）的人類SANS_CENT結構域分別用作誘餌和獵物。

隨後，將誘餌和獵物分別轉化為酵母菌株PJ694a和PJ694A，並利用HIS1、ADE3、LacZ和MEL1報告基因選擇酵母菌落，以鑒定X-ß-gal比色濾波提昇試驗確認的正相互作用。

«——【 ·免疫沈澱/下拉測定· 】——»

GFP標記的蛋白質與HEK3T細胞中指示的293xFLAG標記的蛋白質共表達。轉染後100小時，用含有蛋白酶抑制劑混合物（PI混合物;羅氏）。將裂解物與磁珠在50°C下孵育7小時，然後用5mMTris–HClpH150.0，5mMNaCl，100.2mMEDTA進行幾次洗滌步驟。

結合的蛋白質用4xLaemmli緩沖液洗脫，用SDS-PAGE分離，然後進行蛋白質印跡。FLAG和HA免疫沈澱（IP）是使用抗FLAG（西格瑪）和抗HA親和凝膠（生物工具）珠子進行的。

«——【 ·質譜分析· 】——»

在4–12%Bis-Tris-HCl（pH7.0）NuPAGE聚丙烯酰胺凝膠（Invitrogen）上分離蛋白質，並用G-膠體考馬斯亮藍染色。將Coomassie染色凝膠的泳道切成23片並如前所述處理用於質譜。

當使用相同的色譜和質譜條件以及相同的質譜儀分析蛋白質時，比較兩個樣品中每種蛋白質鑒定的肽數量作為蛋白質相對數量的可靠指示。

«——【 ·細胞培養和細胞係· 】——»

Dulbecco的改良Eagle培養基（DMEM）和含有12%熱滅活胎牛血清（FCS）的DMEM-F10分別用於培養人HEK293T（ATCC），HeLa細胞（ATCC），Flp-In-293和小鼠IMCD3（ATCC）細胞。

質粒按照製造商的方案使用Plus試劑和脂質胺LTX（Invitrogen）遞送到細胞。使用pcDNA293/FRT-PRPF4質粒和Flp-In-5細胞生成穩定表達FLAG/HA標記的人PRPF4的HEK293T細胞。

簡而言之，使用脂質胺293（Invitrogen）以9：1比例的pOG44：pcDNA5/FRT-PRPF4質粒轉染Flp-In-2000細胞，轉染後48小時，在含有潮黴素的培養基中選擇細胞。擴增對潮黴素耐藥的穩定克隆，並通過蛋白質印跡測試FLAG-PRPF4的穩定表達。

«——【 ·敲低和定量逆轉錄聚合酶鏈反應· 】——»

非靶向對照siRNA（siCtrl）購自IDT。對於敲低，HEK293T和HeLa細胞按照製造商的方案使用脂質菌胺RNAiMAX轉染終濃度為20nMsiRNA。

隨後，使用QiagenRNA分離試劑盒從轉染細胞中分離總RNA，並根據製造商的方案使用寡核苷酸（dT）引物通過SuperScript™III第壹鏈合成SuperMix轉換為cDNA。

為了驗證敲低，使用基因特異性引物和iTaqUniversalSYBR綠色超級混合物（Bio-Rad）進行定量PCR（qPCR）。Cq值使用CFXConnect實時熒光定量PCR檢測係統（Bio-Rad）進行檢測。

使用基於GAPDH標準化的ΔΔCq方法計算基因表達譜（引物見補充表S6）。通過蛋白質印跡和免疫熒光分析，還驗證了HEK293T和HeLa細胞中的SANSsiRNA敲低效率。

«——【 ·免疫細胞化學和光學顯微鏡檢查· 】——»

將細胞在–10°C下用甲醇固定20分鐘，或在室溫（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）固定10分鐘，並用PBS洗滌。在室溫下用0.1%Triton-X100（Roth）透化5分鐘，然後用PBS洗滌並用45.0%冷水魚明膠，5.0%卵清蛋白在PBS中封閉1分鐘。

將壹抗在4°C孵育過夜，然後用PBS洗滌並在室溫下與二抗孵育1小時。經過三次洗滌後，用Mowiol4.88（Hoechst）安裝標本，並使用徠卡DM6000B顯微鏡（徠卡）成像。對於STED顯微鏡，我們在Abberior3D-STEDFacilityLine顯微鏡上應用了Abberior的二抗和成像標本。

«——【 ·圖像處理和量化· 】——»

使用徠卡DM6000B顯微鏡（徠卡），徠卡成像和ImageJ/Fiji軟件（43，44）進行圖像處理。徠卡程序使用具有壹個叠代步驟的5-12個Z堆棧和盲去模糊算法設置進行反捲積。Cajal小體和核斑點中積累的平均熒光強度通過先前應用的細胞分析器程序進行量化。

比較了對照組和敲低組之間Cajal小體和細胞核或斑點和細胞核的熒光強度之比。從三個獨立實驗中獲得平均強度和標準偏差值。閾值設置調整如下：綠色通道：手動閾值：0.1;紅色通道：手動閾值0.05。

主要物體尺寸（Cajal天體和原子核）分別以像素為單位設置在2至40和40至100直徑的物體之間。為了根據各種蛋白質在免疫熒光圖像中的接近程度來確定牠們之間的關聯程度，我們使用ImageJ/Fiji程序的Coloc2插件來計算該共分布的Pearson相關係數。

«——【 ·電子顯微鏡· 】——»

對於免疫電子顯微鏡，我們應用了先前建立的預包埋標記技術。如前所述，在Tecnai12BioTwin透射電子顯微鏡（FEI）中分析和記錄標本。圖像使用AdobePhotoshopCS（AdobeSystems）進行處理。

«——【 ·鄰近連接測定（PLA）· 】——»

用於原位鄰近連接測定DuolinkPLA探針抗兔加、防鼠減去和檢測試劑紅是從Sigma購買的。如前所述，在HEK293T細胞上進行PLA。簡而言之，將固定在緩沖的2%多聚甲醛中的細胞與壹抗在4°C孵育過夜，然後在4°C下與寡核苷酸標記的二抗孵育37小時。

經過幾個洗滌步驟後，加入雜交接頭寡核苷酸，並在30°C下連接37分鐘，形成閉環模闆。隨後滾動圓擴增100分鐘，加入熒光標記的寡核苷酸並通過熒光顯微鏡進行分析。

對於陰性對照，樣品僅用壹種蛋白質特異性抗體探測，並與兔或小鼠IgG特異性寡核苷酸標記的抗體配對。將細胞安裝在Mowiol4.88（Hoechst）中，並用徠卡DM6000B顯微鏡進行分析。

«——【 ·體外剪接和剪接體組裝測定· 】——»

從用對照和SANSsiRNA處理的HEK293T細胞制備核提取物。放射性[32將P]標記的MINX預mRNA與40%（v/v）核提取物在含有20mMHEPES–KOHpH7.9，3mMMgCl的剪接緩沖液中孵育2、65mMKCl、2mMATP和20mM磷酸肌酸，在30°C下指定時間點。

分離的RNA要麽在含有15M尿素的變性7%聚丙烯酰胺凝膠上分離，並通過放射自顯影檢測信號或通過RT-qPCR分析信號。將cq值歸壹化為對照，以獲得snRNA結合的相對倍數變化。

為了分析剪接體復合物的形成，通過加入20μl肝素（2mg/ml）在指定的時間點停止剪接反應（5μl），並通過2%天然瓊脂糖凝膠電泳進行分析，然後進行放射自顯影。SANS耗盡核提取物由siSANS處理的HEK293T細胞制備。

«——【 ·SANS與剪接體snRNP復合物和前mRNA結合· 】——»

為了測試SANS是否與剪接體snRNP復合物相互作用，我們使用HEK293T細胞的核提取物進行了共IP，這些細胞表達FLAG標記的SANS或PRPF4，這是U4/U6的核心成分。U5tri-snRNP，在不存在或存在體外合成的 MINX 前mRNA以誘導剪接體形成的情況下。

PRPF4IP的初始北方印跡分析顯示U4，U5和U6snRNA的強雜交信號表明U4/U6的強烈下拉。U5tri-snRNP通過PRPF4在不存在或存在前mRNA的情況下。

相比之下，在沒有MINX前mRNA的情況下，SANS沒有顯著拉低任何U4，U5和U6snRNA，而在剪接條件下通過添加MINX前mRNA誘導剪接體形成後拉低這些snRNA。為了驗證這些數據，我們還通過RT-qPCR分析了SANS和PRPF4下拉中的snRNA。

我們壹致地觀察到與初始北方印跡相似的結果。三個獨立實驗的定量表明，在剪接條件下，snRNA與SANS的結合急劇增加。對snRNA的RT-qPCR的分析也表明，與模擬轉染對照相比，SANS和PRPF4下拉中都存在大量 MINX 前mRNA，表明SANS與前mRNA相互作用。

綜上所述，我們的體外數據表明，SANS與snRNPs不穩定相關，但在剪接條件下與MINX前mRNA上組裝的剪接體復合物相互作用。

«——【 ·SANS存在於核斑點中，其消耗會改變斑點形態· 】——»

由於核斑點是剪接因子儲存，修飾和剪接的重要位點，我們測試了SANS是否存在於這些核體中。我們對SANS和核斑點標記SC35（也稱為SRSF2）進行了共染色。

反捲積顯微鏡顯示細胞核中SANS和SC35的熒光信號重疊，通過合並熒光強度圖和正皮爾遜相關係數值（R =0.5）來確認。3D-STED超分辨率顯微鏡證實了兩種分子在核斑點處的緊密結合，如先前通過超分辨率顯微鏡發現的其他斑點駐留蛋白。

«——【 ·結論· 】——»

在總結我們的研究之後，我們對於SANS（USH1G）在調節前體mRNA剪接中的作用機制有了更深入的認識。通過綜合分析我們的實驗結果，我們得出了以下幾個關鍵的結論：

首先，我們的研究確認了SANS在調節前體mRNA剪接中的重要性。我們的數據表明，SANS的存在對於維持正常的前體mRNA剪接過程至關重要。通過構建細胞模型，我們觀察到SANS缺失或突變會導致前體mRNA剪接事件的異常，進而可能影響編碼蛋白質的正常產生。

其次，我們發現SANS通過介導三snRNP復合物的核內轉移來參與前體mRNA剪接的調控。我們的實驗數據明確顯示，SANS與U1、U2和U5 snRNP復合物之間存在相互作用，並且這種相互作用在核內的轉移過程中發揮關鍵作用。這壹發現為我們闡明了SANS調節前體mRNA剪接的新機制，為細胞剪接調控網絡的解析提供了新的線索。

此外，我們的研究還深化了我們對Usher綜合症的認識。通過揭示SANS與前體mRNA剪接的關聯，我們為Usher綜合症的分子機制提供了更為詳盡的圖景。SANS作為Usher綜合症類型1G的基因，在調控前體mRNA剪接中的作用可能有助於解釋該病的發病機制，為未來的治療研究提供了有價值的信息。

綜上所述，我們的研究為揭示SANS在調節前體mRNA剪接中的作用機制提供了實驗依據和理論支持。這壹發現不僅豐富了我們對於細胞基因表達調控的認識，還有望為相關疾病的治療和幹預提供新的靶點。未來，我們將繼續深入探究SANS與剪接調控網絡的交互關係，以及其在疾病發展中的具體影響，為生物醫學領域的進壹步研究和臨床應用提供有益的貢獻。